Uvod Teorijski dio Eksperimentalni dio Rezultati Rasprava i zakljuèak Literatura

2.2. ELEKTROFOREZA

X Q = f

U slobodnoj otopini otpor se trenja pokorava Stokesovu zakonu:

f = 6 p r v h ,

M = V/Q = Q/6 p r h (cm² /V s)

koja proizlazi iz gornjih dviju jednadžbi, prve koja opisuje silu putovanja èestice prema jednoj od elektroda i druge koja opisuje silu usporavanja èestice nastalu zbog otpora trenja. Pod odreðenim uvjetima elektroforetska je pokretljivost èestice fizikalna konstanta. Ona je izravno razmjerna naboju èestice i obrnuto razmjerna velièini molekule i viskoznosti pufera.

m = ½ å ci zi

gdje ci oznaèuje molarnu koncentraciju jedne vrste iona, a zi naboj ionske vrste i u otopini koja sadrži n iona. Odnosi se na jednovalentne pufere, dok je za izraèunavanje ionske jakosti viševalentnih pufera potrebno poznavati njihovu konstantu disocijacije.

Toplina = E I t = I2 R t,

Gdje E oznaèuje napon, I struju, R otpor, a t vrijeme. Porast temperature dovodi do porasta ionske pokretljivosti i slobodne difuzije te do smanjenja viskoznosti pufera. Stvaranje topline glavni je problem u provedbi svih elektroforetskiha tehnika. Hlaðenje elektroforetskoga sustava stvara pak temperaturni gradijent izmeðu unutrašnje i vanjske površine elektroforetskoga nosaèa koji ovisi o njegovoj debljini, a uzrokuje manju ili veæu iskrivljenost odvojenih zona.

• velièina, oblik, koncentracija, elektrièni naboj, stupanj hidracije i disocijacije èestice

• viskoznost, pH, temperatura i ionska jakost pufera

• jakost elektriène struje

• vrijeme putovanja

Odnos izmeðu elektroforetske pokretljivosti, brzine pokretljivosti, jakosti elektriènog polja, pH i ionske jakosti pufera, jednako se odnosi i na slobodnu i na zonsku eletroforezu. U zonskoj elektroforezi dodatni èimbenici djeluju na elektroforetsku pokretljivost èestice i oštirnu odvajanja u razlièitome stupnju, što ovisi o vrsti elektroforetskog nosaèa. To su adsorpcija, nehomogenost i izmijenjen kapacitet elektroforetskog nosaèa, elektroendoosdmoza, protok pufera mostiæima i drugi. Adsorpcija, elektroendoosmoza i protok pufera mostiæima najizraženiji su pri uporabi filterskog papira, acetatne celuloze, agara i agaroze, dok su vrlo mali ili zanemarivi pri uporabi posebnih vrsta agaroze, škorba i akrilamida kao elektroforetskih nosaèa.

Adsorpcija je svojstvo nekih elektroforetskih nosaèa, posebice filterskog papira i agara, koja slièno “uèinku prosijavanja” smanjuje elektroforetsku pokretljivost èestica koje se odvajaju. U nekim sluèajevima pak adsorpcija može pridonijeti boljem odvajanju èestica.

Elektroendoosmoza je pojava koja se dogaða u tijeku elektroforeze na filterskom papiru, acetatnoj celulozi, agaru i obiènoj agarozi. U dodiru s vodom ovi elektroforetski nosaèi postaju negativno nabijeni zbog adsorpcije hidroksilnih iona. Pozitivni ioni iz otopine nakupljaju se oko ovih nepokretnih iona elektroforetskog nosaèa stvarajuæi ionski oblak sastavljen o pretežno pozitivinih iona. Potencijal koji nastaje izmeðu nepokretnih negativnih iona i pozitivnog ionskog oblaka nazvan je elektrokinetièkim potencijalom ili zeto-potencijalom. Pod djelovanjem elektriène struje negativni ioni elektroforetskog nosaèa ostaju nepokretni, a pozitivni ioni slobodno putuju prema katodi. Buduæi da su ioni u otopini vrlo hidrirani, njihovo putovanje dovodi i do kretanja otapala. To putovanje pozitivnih iona pufera i otapala u odnosu na nepokretni elektroforetski nosaè nazvano je elektroendoosmoza. Nabijene èestice makromolekula koje putuju u suprotnome smjeru moraju savladati ovaj tok hidriranih pozitivnih iona. Ako je sila elektroforeze slabija od sile elektroendoosmoze, putovanje èestica makromolekula bit æe prema katodi. Sila elektroforeza stalna je u svim toèkama duž elektroforetskog nosaèa.

Agaroza ekstrahirana iz morskih algi linearni je polisaharid sastavljen od galaktoze i anhidrogalaktoze a dobivena je iz agara.

Slika 14. Struktura agaroze

Elektroforezom na agaroznom gelu nabijene èestice odvajaju se prema gustoæi naboja. Agorozni gel porozna je mreža a ona je stabilizirajuæi medij za pufer, a pore gela dovoljno su velike da omoguæe slobodna prolaz kroz gel i najveæim molekulama kao što su bjelanèevine. Elektroendoosmoza i adsorpcija su u agaroznom gelu svedene na najmanju moguæu mjeru. Agaroza koja je kupovno dostupna, nije do kraja èista. Ona je kontaminirana s ostalim polisaharidima, solima i proteinima. Kolièina kontaminiranih tvari ovisi od proizvoðaèa do proizvoðaèa. Te razlike mogu djelovati na proces elektroforeze, migraciju DNA i na moguænost da se DNA izolirana iz gela upotrijebi kao supstrat restrikcijsim enzimima. Zbog tih razlika u proteklih 10 godina, proizvoðaèi danas pripremaju posebne agaroze bez inhibitora i nukleaza, a takvi gelovi posjedjuju minimalnu fluorescenciju poslije bojanja s etidij bromidom.

Neki proizvoðaèi kemijski modificiraju agarozu taljenjem na niskoj temeperaturi, bez primjetnih promjena u elastiènosti i èvrstoæi. Tako modificirana agaroza se koristi za elektroforezu DNA i RNA fragmenata izrezanih restrikcijsim enzimima. Specijalne vrste "nisko gelirajuæe temperaturne agaroze" (low-gelling-temeperature agarose) mogu se koristiti za analizu vrlo malih fragmenata DNA (10 - 500 pb). Gelovi napravljeni s agarozom toga tipa imaju veæu rezoluciju nego gelovi napravljeni s normalnom agarozom, ali rezolucija postignuta s tim gelom ne može se mjeriti s rezolucijom postignutom na akrilamidnom gelu. Kako ovaj gel sadrži visoku koncentraciju agaroze (4-10%) DNA fragmenti izoliran iz tog gela kontaminirani su s inhibitorima koji spreèavaju enzimsku manipulaciju. Agarozni gel se priprema taljenjem tj. kuhanjem sa izabranim èistim puferom.

Tablica 2. Elektroforetskih puferi

PUFER	RADNA OTOPINA	SADRŽAJ OTOPINE ( po litri )
TRIS ACETAT - TAE	1* : 0.04 M Tris acetate	50* : 242 g Tris base
	0.001 M EDTA	57.1 ml glacialne octene kiseline
		100 ml 0.5 M EDTA ( pH = 8 )
TRIS FOSFAT - TPE	1* :0.09 M Tris fosfat	10* : 108 g Tris base
	0.002 M EDTA	15.5 ml. 85 % fosforne kiseline gustoæe 1.679 g / ml
		40 ml 0.5 M EDTA
TRIS BORAT - TBE	0.5* :0.045 M Tris borat	5* :54 g Tris base
	0.001 M EDTA	27.5 g boratne kiseline
		20 ml 0.5 M EDTA
ALKALINE	1* :50 ml NaOH	1* :5 ml 10M NaOH
	1 mM EDTA	2 ml 0.5 M EDTA

Molekularna velièina DNA

Slika 15. Dijagram ovisnosti daljine migracije i log10 nukleotidnih parova

Koncentracija agaroze

log u = log uo - Kr T

gdje je uo slobodna elektroforetska pokretljivost a Kr je koeficijent zaostalosti , konstanta koja je povezana sa sadržajem gela i veliènom, oblikom i pokretljivosšæu molekula. Upotrebom razlièitih koncentarcija gelova moguæe je odvojiti DNA fragmente razlièite velièine.

Konformacija DNA

Zatvorena kružnica (oblik 1) otvorena kružnice (oblik 2) i linearna (oblik 3) DNA iste molekulske mase migrira korz agarozni gel u razlièitim duljinama. Relativne pokretljivosti ovih triju oblika primarno ovise o koncentraciji agaroze u gelu ali ovise i u èvrstoæi gela, ionskoj èvrstoæi pufera, i o napetosti superheliksa u obliku 1 DNA.

U odreðenim uvjetima oblik 1 DNA migrira brže od oblika tri, ali u drugim uvjetima obrnuto. Postoji metoda za identifikaciju razlièitih konformacijskih formi DNA a to je elektroforeza u prisutnosti poveæavajuæih kolièina etidij bromida. Kako koncentracija etidij bromida raste i veæe se kolièine vežu na lanac DNA. Negativni okreti u superheliksu (oblik 1) se progresivno odstranjuju i njihova se pokretljivost smanjuje. Kod kritiène koncentracije gdje više ne postoje okreti u superheliksu kolièina migracije u obliku 1 DNA svedena je na minimum. Ako dodajemo još etidij bromida generiraju se pozitivni okreti u superheliksu, a pokretljivost oblika 1 DNA se snažno poveæava. U isto vriejme mobilnost oblika 2 i 3 DNA u razlièitim stupnjevima rezultira negativnim nabojem poveæanjem kolièine etidij bromida u DNA. Za veæinu preparata oblika 1 DNA kritièna je koncentracija slobodnog etidij bromida od 0,1 do 0,5 ug/ml.

Bojanje DNA u agaroznom gelu

Najviše upotrebljavana metoda za vizualizaciju DNA u agaroznom gelu je bojanje s fluorescentnim di-etidij bromidom. Ta tvar sadrži grupu koja se veže izmeðu lanaca baza DNA. Fiksirana pozicija te grupe je približno izmeðu dva lanca DNA a izražava poveæanu fluorescenciju. UV-radijacija kod 254 nm apsorbira DNA a transmitira se pomoæu di-etidij bromida. Radijacija od 302 nm i 366 nm je apsorbirana od lanaca DNA i di-etidij bromida odmah. U oba sluèaja energija se reemitira kod 590 nm u crveno-naranèastoj regiji vidljivog djela spektra.

Zbog flourescencije:

Etidij bromid se može koristiti za detekciju jednostruke ili dvostruke nukleinske kiseline (DNA i RNA). Ali afinitet di-etidij bromida za jednostruku nukleinsku kiselinu je mala, tj. fluorescencija je mala. Etidij bromid se uglavnom priprema kao 10 mg/l otopine u vodi, a uskladištuje se na sobnoj temperaturi u tamnim bocama omotanim s aluminijskom folijom. Di-etidij bromid je uglavnom ugraðen u gel i u elektroforetske pufere u koncentraciji od 0,5 ug/ml. Dodatkom di-etidij bromida elektroforetska pokretljivost dvostruke DNA je reducirana za približno 15%, ali je prednost to da se gel može pregledati direktno.

Uvod Teorijski dio Eksperimentalni dio Rezultati Rasprava i zakljuèak Literatura